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9.4 水质的细菌学检测 |
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9.4.1 水中细菌总数的检测 |
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9.4.1.1 目的和原理 |
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水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关，它是评价水质污染程度的一个重要指标之一。由于重金属及某些其它有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，因此总细菌数少的水样，并不能排除已被这些物质所污染。
本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是一种测定水中好氧的和兼性厌氧的异养细菌密度的方法，由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细期总数是指1毫升水样在营养琼脂培养基中，37℃、24小时培养后所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水中总菌数不得超过 100个。 |
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9.4.1.2 材料和器皿 |
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（1）培养基
①营养琼脂培养基
②2216E培养基：
蛋白胨 5.0克;
酵母膏 1.0克;
FePO4 0.01克;
琼脂 18.0克;
陈海水 1000毫升;
pH 7.6～7.8
（2）无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养皿，盛有90ml及 9mL灭菌蒸馏水的锥形瓶和试管。 |
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9.4.1.3 方法和步骤 |
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（1）采集水样。
（2）吸取10 ml水样（河水、污水、游泳池水或港湾水等），注入盛有90ml无菌水或无菌海水的三角瓶中，混匀成10-1稀释液，在吸水样前，水样应彻底搅动均匀。
（3）按10倍稀释法将水样稀释成10-2、10-3、10-4。
（4）根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4稀释度；中等的选取10-1、10-2、10-3稀释度，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿 1ml。稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30—300个之间。
（5）注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培养基（用于河水样）或2216E培养基（用于海水、港湾水样）约15ml，立即旋摇培养血，充分混匀，水平放置至固化。
（6）接种河水的培养皿，倒置于37℃培养24小时。接种海水样，港湾水样的培养皿，应倒置后于18—20℃下培养到长出明显菌落（5天左右）止。 |
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9.4.1.4 结果与分析 |
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取同一稀释度的平板培养物，依菌落计算原则进行计算。
（1）菌落计算原则
平皿菌落的计算，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。对长得相当接近，但不相触的菌落，应予以—一计数。对链状菌落，应当作为一个菌落来计算。平皿中若有较大片状菌落时则不宜采用，若片状菌落少于平皿的一半时，而另一半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。算出同一稀释度的平均菌数，供下一步计算时用。
（2）计算方法
①首先选择平均菌落数在30～300者进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数（见表5－9的例1）。
②若有两个稀释度的平均菌落数都在30—300之间，则应按两者的比值来决定。若其比例小于2，应报告两者的平均数；若大于2，则报告其中较小的数字（见表7-例2和例3）。
③如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表5－9例4）
④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表5－9例5）。
⑤如果全部稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表5－9例6）。
③菌落计数的报告，菌落在100以内时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表5－9的“报告方式”栏）。 |
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表5－9 稀释度选择及菌落报告方式 |
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例次 |
不同稀释度的平均菌落数 |
两个稀释度菌落数之比 |
菌落总数（个／ml） |
报告方式（个／ml） |
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10 -1 |
10 -2 |
10-3 |
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1 |
1360 |
164 |
20 |
- |
16400 |
16000或1.6×104 |
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2 |
2760 |
295 |
46 |
1.6 |
37750 |
38000或3.8×104 |
| |
3 |
2890 |
271 |
60 |
2.2 |
27100 |
27000或7×104 |
| |
4 |
无法计数 |
4651 |
513 |
- |
513000 |
510000或5.1×105 |
| |
5 |
27 |
11 |
5 |
- |
270 |
270或2.7×102 |
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6 |
无法计数 |
305 |
12 |
- |
30500 |
31000或3.1×104 |
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9.4.2 水中大肠菌群（Coliform group）细菌的检测 |
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9.4.2.1 目的和原理 |
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如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染而引起肠道传染病。由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个。
大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，能发酵乳糖，在乳糖培养基中经37℃ 24小时培养，能产酸产气，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌。
本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，此一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。本法除了用于检测水样（淡水或海水）外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50克样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡1—2分钟，便成10-1稀释，以用于检验。 |
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9.4.2.2 材料与器皿 |
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（1）培养基
二倍浓度的乳糖胆汁液体培养基
一倍浓度的乳糖胆汁液体培养基
伊红——美蓝琼脂（E．M．B．）培养基
亮绿乳糖胆汁（B．G．B）液体培养基
营养琼脂培养基
（2）灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染液、灭菌培养皿 |
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9.4.2.3 方法与步骤 |
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（1）假定试验
①用10ml水样，接种到二倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接三支 。
②用lml水样，接种到一倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接种三支。
③制备水样 10-1和 10-2的稀释液。
④分别接种lml10-1和 10-2稀释液到一倍浓度的乳糖胆汁管中，每个稀释液接种三支。
⑤在35℃中培养48小时，观察有无气体和酸产生。
⑥在48小时以内，培养管内倒置的杜汉氏管中有任何量的气体积累，便可断定为阳性假定试验。若培养管内液体清晰而杜氏管中有气泡时，可能为放置不当而残存的空气泡，不可与产气的阳性反应相混同。无气泡着为阴性。产酸者呈黄色。
(2) 确信试验
①取呈阳性和阳性可疑的初步发酵试管，轻轻振荡或转动，然后以无菌的金属接种环，转移1环培养物至亮绿乳糖胆汁管中，于35C℃培养48小时。如在倒置的杜汉氏管中产气，不论其量多寡，皆为阳性确信试验。
②凡初步发酵试验管在24小时之前就显示活跃的发酵（产气量占杜汉氏管10％以上）的试管，应及时转移至确信试验的培养基。
（3）完成试验
①取上述阳性确信试验管，在伊红一美蓝平板上划线分离，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：a．划线间距至少相隔0.5厘米; b．接种针尖端要稍弯曲;c．先对发酵管轻击，并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣，d.划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面，以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于35C培养24小时。
② 24小时后，观察在EMB平板上出现的单个菌落，具核心及深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37 ℃培养24小时。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在。
③ 在EMB平板上呈较典型的大肠菌群细菌还可再次转接至乳糖胆汁发酵管中，在37℃下培养48小时，产生气体者即确认了大肠菌群细菌的存在。
④ 根据证实有大肠菌群细菌存在的阳性管数查表5－10，以确定大肠菌群数。整个试验的步骤见图5－7所示。 |
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图5－7 大肠菌群细菌的检测 |
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9.4.2.4 结果及分析 |
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将上述各个试验阶段的结果列表记录，并最后算出水中所含大肠菌群的最大可能值（表5－10）。 |
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表5－10 最近似数（MPN）指数和95%置信度检索表 |
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出现阳性反应的试管数 |
每100ml中的MPN指数 |
95% 置信度 |
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在3支10ml 试管中 |
在3支1ml 试管中 |
在3支0.1ml 试管中 |
下限 |
上限 |
| |
|
0 |
0 |
1 |
3 |
<0.5 |
9 |
| |
|
0 |
1 |
0 |
3 |
<0.5 |
13 |
| |
|
1 |
0 |
0 |
4 |
<0.5 |
20 |
| |
|
1 |
0 |
1 |
7 |
1 |
21
|
| |
|
1 |
1 |
0 |
7 |
1 |
23 |
| |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3 |
36 |
| |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3 |
36 |
| |
|
2 |
0 |
0 |
9 |
1 |
36 |
| |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3 |
37 |
| |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3 |
44 |
| |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
7 |
89 |
| |
|
2 |
2 |
0 |
21 |
4 |
47 |
| |
|
2 |
2 |
1 |
28 |
10 |
150 |
| |
|
3 |
0 |
0 |
23 |
4 |
120 |
| |
|
3 |
0 |
1 |
39 |
7 |
130 |
| |
|
3 |
0 |
2 |
64 |
15 |
380 |
| |
|
3 |
1 |
0 |
43 |
7 |
210 |
| |
|
3 |
1 |
1 |
75 |
14 |
230 |
| |
|
3 |
1 |
2 |
120 |
30 |
380 |
| |
|
3 |
2 |
0 |
93 |
15 |
380 |
| |
|
3 |
2 |
1 |
150 |
30 |
440 |
| |
|
3 |
2 |
2 |
210 |
35 |
470 |
| |
|
3 |
3 |
0 |
240 |
36 |
1300 |
| |
|
3 |
3 |
1 |
460 |
71 |
2400 |
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|
3 |
3 |
2 |
1100 |
150 |
4800 |
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本试验所用的培养基系选择培养基，许多细菌都不能利用培养基中的乳糖来发酵产气产酸，而大肠菌群细菌及少数其它种类的细菌可发酵乳糖产气产酸。培养基中的胆汁（牛、羊或猪的胆酸盐）是表面活性剂，它不会抑制大肠菌群细菌的生长，但能抑制其它革兰氏阳性细菌，如芽孢形成菌的生长。在胆汁缺乏时可用0.1克的十二烷基磺酸钠替代。溴甲酚紫（或亮绿）是pH的指示剂，大肠菌群在发酵乳糖产气外还同时产酸，该指示剂有助于我们判断发酵的进程。
在假定试验的初步发酵管中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过确信试验和完成试验，对初步发酵中的阳性可疑管进行复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态观察，即可将那些少量的非大肠菌群细菌（“假阳性管”）删除去，放在记录时须把三步试验都呈阳性的试管数计入阳性反应管。
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9.4.2.5 培养基配制 |
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（1）乳糖胆汁液体培养基：
蛋白胨 20.0克;
乳糖 5.0克;
胆酸钠 5.0克;
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1毫升;
蒸馏水 1000毫升.
将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000毫升蒸馏水中，调pH至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1毫升，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115℃灭菌20分钟。
（2）伊红－美蓝琼脂（E．M．B）培养基
①蛋白胨琼脂培养基（其成分为蛋白胨10.0克；琼脂18.0克；蒸馏水1000毫升；pH7.6）;
②20％乳糖 2毫升;
③2％伊红溶液 2毫升;
④0.5％美蓝溶液 1毫升;
将已灭菌的蛋白胨琼脂培养基加热溶化，冷却至60 ℃左右时，将已灭菌的乳糖溶液、伊红溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入，摇匀后即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏，故必须严格控制灭菌温度，一般为115℃，20分钟。
（3）亮绿乳糖胆汁（B.G.B.）液体培养基
蛋白胨 10.0克;
乳糖 10.0克;
胆酸钠 20.0克;
亮绿 0.0133克;
蒸馏水 1000毫升;
pH 7.4 ;
分装试管后，加入杜汉氏小管，115℃灭菌20分钟。
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